پایگاه علمی سعید سان دانلود رایگان مقالات علمی کنفرانس و ژورنال
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته علوم جانوری گرایش زیست شناسی تکوینی /عنوان پایان نامه : بررسی اثرات القاء تمایز ناشی از کاربرد عصاره غضروف جنین رت نژاد ویستار بر روی سلول های بنیادی مزانشیم بند ناف
M.S.c Thesis
Animal Cell & Developmental Biology
Investigation on the inductive effect of extract cartilage foetus of wistar Rats on the umbilical cord mesenchymal stem cell
چکیده : ازویژگی های منحصر به فرد سلول های بنیادی توا نایی چسبیدن به سطوح مختلف از جمله پلاستیک و شیشه است. در این مطالعه سعی شده است که از این ویژگی سلول ها به روش بهینه به منظور جدا سازی و تولید رده سلولی از سلول های بنیادی مزانشیم بند ناف رت استفاده گردد. سه ساعت پس از آغاز کشت، محیط رویی دور ریخته می شد ودو تعویض بعدی در فواصل زمانی 24 ساعت یکبار صورت می گرفت و از روزسوم به بعد سه روز یکبار تعویض ها انجام می شد بعداز پاساژ اول رده سلولی با درصد خلوص بالاتولید گردید.
به منظور اثبات ماهیت بنیادی بودن و مزانشیمی بودن سلول ها از روش فلو سایتو متری استفاده گردید.برای اثبات مزانشیمی بودن این سلول ها مارکر های CD73,CD90,CD44 مورد استفاده قرار گرفتندوبرای اثبات عدم ماهیت خونی آن ها مارکر CD45بکار برده شد. مارکر CD31 برای اثبات عدم ماهیت اندو تلیالی این سلول ها انتخاب گردید.همه این مارکر ها به روش رنگ آمیزی مستقیم به کار رفتند.
نتایج به دست آمده نشان داد که ابراز مارکرهای CD31 وCD45 پایین بوده واین موضوع نشان دهنده از بیان کم مارکر هایCD45,CD31بودکه نشان دهنده این بود که بخش اعظم سلول های حاصل سلولهای بنیادی اندو تلیالی هستند و خونی نمی باشند. ولی بیان نسبتا بالای مارکر 90CD وCD73 نشان دهنده مزانشیمی بودن این سلول ها و بیان نسبتا کمتر CD44مبین این بود که سلول های مزانشیمی حاصل موشی هستند .
برای ایجاد تمایز به سمت کند روبلاست ها نیاز به تراکم سلولی مناسب و فاکتور هایی که القاء کننده روند غضروفی شدن به سلول های بنیادی باشند، وجود دارد . برای ایجاد تراکم سلولی مناسب به روش Micro mass تعداد سلول ها در واحد سطح اضافه شدند.افزودنی هایی مانند آسکوربیک اسید و دگزامتازون که می توانند در ایجاد روند متراکم سازی سلول هاو نگهداری این تراکم کمک کنند مورد استفاده قرار گرفتند.همچنین گلوکز آمین نیز پلی سا کاریدی است که می تواند محرک تشکیل پروتئو گلیکان ها باشد، مورد استفاده قرار گرفت اما هیچ کدام از این مواد به تنهایی یا با هم مسیر تمایزی سلول ها را به سمت غضروفی شدن پیش نبرد . گرچه به هنگام استفاده از غلظت معینی از دگزا متازون و اسید آسکوربیک به نظر می رسید که روند تمایز به سمت عصبی شدن سلول ها پیش می رود . اما با اضافه کردن عصاره ی غضروف نوزاد های یک روزه ی رت روند متراکم شدن و بیضوی شدن سلول ها افزایش یافت. رنگ آمیزی اختصاصی آلسیان بلوکه رنگ اختصاصی ماتریکس خارج سلولی است به منظور اثبات کندرو بلاستی شدن سلول ها ی مزانشیمی مورد استفاده قرار گرفت، این رنگ معمولا ماتریکس سلولی حاوی اگریکان سولفاته را به رنگ آبی مشخص مینماید . به طور کلّی میتوان گفت: که این روش در جهت جداسازی سلول ها ی مزانشیمی بند ناف و تولید رده سلولی کاملا موفق و توانمند بوده و در جهت ایجاد تمایز نیز پیشرفت مناسب و قابل قبولی، به ویژه در ایجاد روند متراکم سازی و تولید کندروبلاست ها و همچنین تولید سلول ها ی شبه عصبی داشته است.
کلمات کلیدی:سلول های مزانشیمی بند ناف، عصاره غضروف، تمایز، رت نژاد ویستار، مارکرهای سلولی.
1-1 سلول های بنیادی ( Stem Cells )
سلول های بنیادی، سلولهایی با پتانسیل تمایز به انواع دیگر سلولها و قدرت تقسیم نامحدود هستند3)(2)) (1). این سلول ها را می توان از جنین قبل از لانه گزینی، بند ناف و یا بافت های افراد بزرگسال به دست آورد که به ترتیب آنها را سلول های بنیادی جنینی ،4)(5) )، بند ناف (6) و یا سلول های بنیادی بزرگسالان (7) می گویند. ابتدا از نظر پتانسیل تکثیر و تمایز ، هر کدام از این سلول های بنیادی متفاوت هستند بطوری که این پتانسیل از سلول های بنیادی جنینی به سلول های بنیادی بزرگسالان کاهش می یابد (8). دانشمندان معتقدند که سلولهای بنیادی نه تنها در توسعه طب پیوند و درمان بیماری های صعب العلاج چون جراحت های نخاعی، آسیب های عروقی ، دیابت ، بیماری های قلبی عروقی و …می توانند موثر باشند، بلکه این سلول ها می توانند در توسعه داروسازی ، ناهنجاری شناسی جنین ها و بیان عملکرد ژن ها نیز موثر واقع گردند. حتی می توان به کمک بررسی این سلول ها چگونگی تکوین اندام هایی چون قلب ، مغز و… را مورد بررسی قرار داد.البته کشف و تولید سلول های بنیادی و تمایز آنها تنها یک نقطه آغاز است. آغاز تحقق رویای ترمیم سلول ها ، بافت ها و یا اعضای جراحت دیده بدن انسان ، زیرا تا کاربرد این سلول ها در درمان بیماری ها هنوز راه نسبتاً درازی در پیش است از جمله این مشکلات پاسخ دادن به پرسش هایی از قبیل:
– چه تعداد سلول را باید پیوند داد؟
– چگونه این پیوند انجام پذیرد؟
– سلول ها را باید به شکل تمایز یافته کامل پیوند زد یا بعد از شروع تمایز؟
– آیا سلول ها در محیط طبیعی بدن هم مانند محیط کشت عمل می کنند؟
– و …
1-1-1 ویژگی های سلول های بنیادی مزانشیمی ( M S C s ) :
الف) خود نوزایی( Self – Renewal) :
پدیده خود نوزایی توانایی انجام چرخه سلولی و حفظ مرحله تمایز نیافتگی است به این معنی که این سلول ها قادرند با تقسیم میتوزی خود کپی های مشابه با سلول های مادری ایجاد نمایند و این توان را برای مدت طولانی حفظ نمایند. البته باید دانست که بطور دقیق میزان این پتانسیل مشخص نیست زیرا در مطالعات مختلف سلول های بنیادی مزانشیمی جدا شده توانایی های متفاوتی برای خود نوزایی از خود نشان می دهند.(9) ثابت شده است که علیرغم خصوصیت خود بازسازی ، سلول های بنیادی خون به راحتی در شرایط in vitro تکثیر نمی یابند، در حالی که تکثیر سایر سلول ها نظیر سلول های بنیادی عصبی و سلول های بنیادی جنینی آسان است (10) از دست دادن این خصوصیت در محیط کشت استفاده درمانی سلول های بنیادی خون ساز را محدود می کند.
ب)توان تمایز سلولی ( Potency of Differentiation) :
این ویژگی به معنای توانایی تمایز یافتن به انواع سلول های تخصص یافته است مکانیسم مولکولی پدیده تمایز سلول های بنیادی کاملاً شناخته شده نیست دانشمندان معتقدند که عوامل مختلفی در متعهد شدن سلول های بنیادی مزانشیمی در تمایز به رده خاص سلولی دخیل است.این عوامل شامل ترکیب سرم ، تیمار های مختلف ، نوع پلاستیک مورد استفاده در کشت سلول و تعامل سلولی است. با فراهم شدن شرایط مناسب ، سلول های بنیادی مزانشیمی قادر اند به انواعی از سلول ها شامل سلول های استخوانی ، چربی و غضروفی تمایز یابند. (11)
سلول های بنیادی مزانشیمی حتی در کشت اولیه سلولی کلون زا هستند. بررسی ها نشان می دهند که کلون های منفرد که هر کدام از یک سلول مشتق شده اند از لحاظ پتانسیل تمایز هتروژن هستند یعنی حدود یک سوم کلون های کشت اولیه از لحاظ تمایزی می توانند به هر سه رده سلولی چربی ، استخوان و غضروف تمایز یابند اما دو سوم دیگر یا به دو رده و یا تنها به یک رده سلولی تمایز می یابند. (12)
یکی از ویژگی های سلول های مزانشیمی و در حقیقت یکی از راه های شناخت سلول های مزانشیمی توانایی تبدیل شدن آنها به چربی، غضروف و استخوان در محیط آزمایشگاه است. در یک مطالعه جالب نشان داده شده که سلول های مزانشیمی که تحت شرایط تبدیل به استخوان قرار می گیرند حداکثر تا 30 روز توانایی تبدیل به سلول های چربی و غضروفی را حفظ می کند. حتی سلول های کاملا تمایز یافته نیز این توانایی را دارند. جالب تر اینکه سلول های تمایز یافته غضروف و چربی از سلول های مغز استخوان نیز توانایی تبدیل شدن به سایر سلول های رده مزانشیمی را در خود حفظ می نمایند
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده فارسی
فصل اول :مقدمه 1
1 -1-سلول های بنیادی (Stem Cell) 2
1 -1-1-ویژگی های سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs ) 3
1-1-2-تقسیم بندی انواع سلول های بنیادی براساس توان تمایزی 5
1-1-3-تقسیم بندی انواع سلول های بنیادی از نظر منشاء 5 1-1-4-مارکر های سلول بنیادی (Stem Cell Markers) 6 1-1-5-منا بع سلول های بنیادی مزانشیمی 8
1-1-6-امتیاز سلول های بنیادی مزانشیمی بند ناف 8 1-1-7-سلول ها بنیادی استرومایی / مزانشیمی بند ناف 8
(Stromal /Mesenchymal Stem Cell Umbilical Cord)
1-2-غضروف(Cartilage) 11
1-2-1 غضروف هیالن 11
1-2-1-1-پری کوندریم 12 1-2-1-2-کندروسیت 13 1-2-2-غضروف الاستیک 13 1-2-3-فیبروکارتیلاژ 13
1-3-هیستوفیزیولوژی 14
1-4-هیستوژنز 15
1-5-مراحل رشد غضروف 16 1-6-ترمیم غضروف 16 1-7-رشد و نمو دستگاه اسکلتی 16
1-8-عوامل موثر در تشکیل غضروف 17
1-9-انواع کشت بافت 20
1-10-شروع کشت 21
1-11-پیر شدن سلولهای مزانشیمی 23 1-12-روش های ایجاد تمایز جهت دار در آزمایشگاه 23
1-13-فلوسایتومتری 25
1-14-ایمنوفلوئورسانس 27
1-14-1-آماده سازی سلولها 28
1-14-1-1-تهیه سوسپانسیون منفرد سلولی 28
1-14-1-2-فیکساسیون یا تثبیت سلولها 28
1-14-1-3-نفوذ پذیر کردن سلولها 29
1-14-2-رنگ آمیزی 30
1-15-اثبات حضور سلول های غضروفی 31
1-16-اهداف این تحقیق 32
فصل دوم : وسایل ،مواد وروش ها 34
2-1-دستگاه ها و مواد مورد نیاز 35
2-1-1-دستگاه ها و ابزارهای مورد نیاز 35
2-1-2-مواد مورد نیاز 37
2-2-روش های اجرایی کار 39
2-2-1-جانور مورد آزمایش 39
2-2-2-شرایط نگهداری حیوانات 39 2-2-3-آماده کردن حیوانات برای آزمایش 40
2-2-4-محلول های مورد نیاز و طرز تهیه آنها 40
2-2-5-استریل کردن محلول ها و ظروف کشت و سطوح کار 42 2-2-6-جدا کردن سلول های بنیادی استرومایی بند ناف و کشت اولیه آن 43
2-2-7-پاساژ دادن 48
2-2-8-کشت در پلیت 49
2-2-9- روش انجام انالیز فلوسایتومتری بر روی سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف 51
2-2-10-تهیه عصاره غضروف 53
2-2-11-تاثیر عصاره غضروف برروی سلولهای بنیاد ی مزانشیمی بند ناف 54
2-2-11-1 گروه تجربی اول: کشت سلولهای بنیاد ی مزانشیمی بند ناف همراه با عصاره غضروف به مدت 21 روز 55
2-2-11-2 گروه تجربی دوم: کشت سلولهای بنیاد ی مزانشیمی بند ناف بادگزامتازون و اسیدآسکوربیک به مدت 7 روز 57
2-2-11-3 گروه تجر بی سوم: کشت سلولهای بنیاد ی مزانشیمی بند ناف بادگزامتازون وگلوکز آمین به مدت 14 روز 57
2-2-11-4 گروه تجربی چهارم: کشت سلولهای بنیاد ی مزانشیمی بند ناف بادگزامتازون و اسید آسکوربیک و گلوکز آمین به مدت 14 روز 57
2-2-12-روش رنگ آمیزی آلسیان بلو(Alcian blue) 58
فصل سوم : نتایج 59
3-1-نتایج حاصل از بررسی حضور سلول های بنیادی 60 3-1-1-نتیجه کشت اولیه سلول های جدا شده از استرومای بند ناف 3 ساعت بعد از کشت 60
3-1-2-نتیجه کشت اولیه سلول های جدا شده از استرومای بند ناف 24 ساعت بعد از کشت 61
3-1-3- نتیجه کشت اولیه سلول های جدا شده از استرومای بند ناف 48 ساعت بعد از کشت62
3-1-4-نتیجه کشت اولیه سلول های جدا شده از استرومای بند ناف 4 روز بعد از کشت 63
3-2 -کشت سلولی بعد از پاساژ اول و تولید لاین سلولی (Cell Line) 63
3 -3-انالیز داده های مربوط به سلول های بنیادی مزانششیمی بند ناف توسط دستگاه فلوسایتومتری63
3-4-نتایج حاصل از شمارش سلول هابه هنگام انتقال به پلیت 69
3-5-نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با عصاره غضروف به مدت 21 روز 69
3-5-1-گروه تجربی اول : نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با 2 درصد عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی به مدت 21 روز 69
3-5-2- نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با 10 درصد عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی به مدت 10 روز 73
3-5-3- نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با 25درصد عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی به مدت 10 روز 74
3-5-4- نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با 50درصد عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی به مدت 10 روز 74
3-5-5- نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف همراه با 75درصد عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی به مدت 10 روز 74
3-6 –نتایج گروه تجربی دوم: کشت سلولهای بنیادی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده76 اصلی و فقط در حضور اسید آسکوربیک ودگزامتازون به مدت 7 روز 75 3-6-1-نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی و فقط در حضور اسید آسکوربیک ودگزامتازون در روز دوم 75 3-6-2-نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی و فقط در حضور اسید آسکوربیک ودگزامتازون در روز پنجم 75 3-6-3-نتایج کشت سلولهای بنیادی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی و فقط در حضور اسید آسکوربیک ودگزامتازون در روزهفتم 77 3-7- نتایج گروه تجربی سوم :کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی فقط با حضور دگزامتازون و گلوکز آمین به مدت 14 روز 78 3-8- نتایج گروه تجربی چهارم :کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف بدون عصاره غضروف به عنوان القاء کننده اصلی فقط با حضور دگزامتازون واسید آسکوربیک و گلوکز آمین به مد ت 14 روز79
3-9-نتایج حاصل از حضور سلول های غضروفی با رنگ آمیزی آلسیان بلو 79
فصل چهارم: 82
4-1 -بحث وتفسیر 83
پیشنهادها 91
منابع ومآخذ 92
چکیده انگلیسی 104