بررسی تنوع ژن Coa در استافیلوکوکوس اورئوس های جدا شده از نمونه های بالینی در رشت

دانشکده علوم پایه

گروه آموزشی میکروبیولوژی

پایان­نامه تحصیلی جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد

رشته:زیست شناسی سلولی و مولکولی گرایش: میکروبیولوژی

عنوان:

بررسی تنوع ژن Coa در استافیلوکوکوس اورئوس های جدا شده از نمونه های بالینی در رشت

چکیده

استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل بیماریزای متداول در انسان و دام است که طیف وسیعی از بیماریها را ایجاد میکند و آنزیم کوآگولاز از عوامل مهم بیماریزای این باکتری می باشد. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی ژن کد کننده این آنزیم (coa)  یکی از روش های مولکولی تعیین تیپ جدایه های استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. در این مطالعه 30 جدایه بالینی استافیلوکوس اورئوس جدا شده از نمونه های مختلف مثل ادرار، پوست و خون در رشت مورد استفاده قرار گرفت. برای تعیین تیپ کوآگولاز منطقه بسیار متغیر ژن این آنزیم در واکنش PCR تکثیر وسپس مورد هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز محدودگر AluI قرار گرفت و تنوع طول قطعات هضم آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت. در مجموع در واکنش PCR دو نوع محصول ( به طول های 680 و 750 جفت باز) و شش الگوی مختلف RFLP (280+400, 280+470،340+340  و عدم هضم قطعه 750 جفت بازی) بدست آمد. نتایج بیانگر تنوع ژن کوآگولاز در جدایه های استافیلوکوکوس اورئوس در منطقه می باشد و الگوی PCR-RFLP 280+400 جفت بازی الگوی غالب بوده است

1-1- مقدمه

استافیلوکوک تنها جنس در خانواده میکروکوکاسیه می باشد که اهمیت پزشکی دارد. استافیلوکوک ها، کوکسی های گرم مثبت و بی هوازی اختیاری هستند که با آرایش خوشه انگوری رشد می کنند. نام استافیلوکوک از ریشه یونانی استافیل(به معنای یک خوشه انگور) و کوکوس(به معنای یک دانه یا حبه) گرفته شده است. برای اولین بار این واژه در توصیف ارگانیسم هایی استفاده شده که در ترشحات چرکی زخم های جراحی وجود داشته اند.

استافیلوکوک ها در همه جا یافت می شوند. آنها رایج ترین ارگانیسم ها در پزشکی هستند. علی رغم عرضه عوامل ضد میکروبی و بهبودی بهداشت( که نقش موثری در کاهش شیوع و مرگ و میر بیماری های استافیلوکوکی در قرن بیستم داشته است) هنوز استافیلوکوک ها به عنوان بیماری زاهای مهم بیمارستانی باقی مانده اند. آنها مسئول بیش از 80% از بیماری های چرکی می باشند که در بالین بیمار یافت می شوند و بعد از اشرشیا کلی، دومین علت عفونت های بیماران بستری در بیمارستان را به خود اختصاص می دهند. جایگاه طبیعی اولیه استافیلوکوک ها، سطح بدن پستانداران می باشد که در آن ارگانیسم ها به تعداد زیادی یافت می شوند.  در تطابق با زندگی انگل ، استافیلوکوک ها با استعداد ترین و موفق ترین باکتری های بیماری زا هستند. اگر سد دفاعی بدن میزبان به علت جراحت و یا جراحی، آسیب ببیند و ارگانیسم ها در بافت زمینه ای نفوذ کنند قدرت تهاجمی نهفته آنها آشکار خواهد شد. از هنگامی که جریان خون مورد تهاجم قرار می گیرد استافیلوکوک ها می توانند اندوکاردیت حاد و ضایعات متاستیک منتشر را ایجاد کنند. فاکتور عمده ای که موجب شده است تا اینکه علی رغم عرضه بسیاری از آنتی بیوتیک های ضد استافیلوکوکی (در مدت 40 سال گذشته) باز هم ارگانیسم ها بقای خود را حفظ کنند این ویژگی مربوط به توانایی آنها در مقاوم شدن در برابر عوامل ضد میکروبی است. سوش های مقاوم در برابر پنی سیلین(و مشتقات آن) و همراهی این سوش ها با درگیری های اپیدمیک عفونت های شدید بیمارستانی، بیشترین توجه را به خود جلب کرده است از میان 20 گونه استافیلوکوک، فقط 3 گونه از آنها : استافیلوکوک اورئوس، استافیلوکوک اپیدرمیس و استافیلوکوک ساپروفیتیکوس اهمیت بالینی دارند. سوش های جوان برخی از استافیلوکوک ها پیگمان زرد را تولید می کنند. این ارگانیسم ها تحت عنوان استافیلوکوک اورئوس نامیده شدند تا از سوش های با قدرت بیماری زایی کمتر(استافیلوکوک های تولید کننده کلونی سفید) متمایز شوند. تولید پیگمان ویژگی متغیری در استافیلوکوک ها است و ارتباط آن با بیماری زایی قطعی نیست. امروزه توانایی تولید کواگولاز جایگزین نوع پیگمان در کلونی ها شده است. توانایی تولید کواگولاز مفید ترین معیار تشخیص برای استافیلوکوک اورئوس می باشد.اگر چه که استافیلوکوک اورئوس مهمترین بیماری زا برای انسان می باشد، استافیلوکوک های کواگولاز- منفی نیز از عوامل بیماری زا در عفونت های بیمارستانی هستند (10 , 8 )    استافیلوکوکوس اورئوس یکی از پاتوژن های مهم و دومین عامل شایع در عفونت های بیمارستانی می باشد که مسئول عفونت های سطحی پوست تا بسیاری از عفونت های جدی نظیر سپتی سمی ، اندوکاردیت و استئومیلیت در افراد بستری در بیمارستان ها و از عوامل شایع مرگ و میر در بیماران تحت همودیالیز می باشد(7 , 8 , 10 ).

تصویر1-1-  تصاویر سمت راست وچپ به ترتیب توسط میکروسکوپ های نوری و الکترونی از باکتری استافیلوکوک اورئوس گرفته شده است

1-2- بیان مساله

از آنجا که مقاومت نسبت به داروهای ضد میکروبی در حال گسترش است و استافیلوکوکوس اورئوس بیش از اکثر باکتریهای دیگر مقاومت دارویی نشان می دهد مکانیسم های دفاعی سیستم ایمنی به عنوان استراتژی ضد میکروبی این باکتری بسیار مورد توجه می باشد. از طرفی استافیلوکوکوس اورئوس به روش های مختلفی در برابر مکانیسم های دفاعی بدن مقاومت کرده یا از آن می گریزد. تولید آنزیم کوآگولاز توسط استافیلوکوکوس اورئوس بسیار مورد توجه میکروب شناسان بالینی بوده به عنوان یک شاخص مهم در شناسایی این باکتری به حساب می آید. آنزیم کوآگولاز در استافیلوکوک اورئوس یک آنزیم خارج سلولی می باشد که عملکرد ی همانند عمل تبدیل فیبرینوژن به فیبرین دارد که توسط ترومبین کاتالیز می گردد. کواگولاز-ترومبین نه تنها موجب انعقاد فیبرینوژن می گردد بلکه موجب فعالیت پروتئولیتیک و استرئولیتیک نیز می گردد. کواگولاز با ایجاد سدی از فیبرین در دور محل ضایعه، استافیلوکوک را در مقابل فاگوسیتوز به وسیله گلبول های سفید محافظت می کند(8).  ژن coa که پروتئین کوآگولاز را کد می کند به علت داشتن توالی های متغیر در ناحیه کدکننده ´3 بسیار پلی مورف است و می تواند در متمایز کردن جدایه های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. ناحیه متغیر ژن coa از توالی های تکراری 81 جفت بازی تشکیل شده است که تعداد تکرار این توالی ها در سویه های مختلف استافیلوکوکوس اورئوس متغیر است(44,101 ).در بسیاری از کشور ها تعیین ژنوتیپ استافیلوکوکوس اورئوس بخشی از برنامه های سیستم های نظارتی بوده ابزار مهمی در مطالعه منشاء سویه ها ،تعیین ارتباط کلون ها و اپیدمیولوژی موارد شیوع است. مولکولار تایپینگ نقش اساسی در مطالعات اپیدمیولوژیک عفونت های فرصت طلب ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس دارد. کاراترین روش تایپینگ مولکولی Pulsed Field gel Electrophoresis می باشد که تکنیک پیچیده، گران و وقت گیری است. به همین دلیل تلاش هایی در جهت دست یابی به تکنیک های ساده ، سریع و ارزان انجام پذیرفت. مطالعات مختلف نشان داد تکثیر مناطق ژنی بسیار متغیر و آنالیز هضم آنزیمی محصول (PCR-RFLP) یکی از روش های کارا در تایپینگ مولکولی استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. در پژوهش حاضر 30 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس از نظر پلی مورفیسم در ژن coa بررسی ، وجود و عدم وجود ارتباط معنی دار بین ژنوتیپ coa و نوع عفونت بالینی ( موضعی یا سیستمیک بودن آن ) بررسی می گردد.

تصویر 1-2- مکانیسم تبدیل فیبرینوژن به فیبرین

1-3- اهمیت و ضرورت

شیوع گسترده و اهمیت بهداشتی عفونت های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس سبب شد در سراسر دنیا، تحقیقات گسترده در مورد ژن های موثر در پاتوژنز و شناسایی بیوتیپ ها و ژنوتیپ های مختلف این باکتری انجام گیرد. کوآگولاز به عنوان مهم ترین عامل پاتوژنز در استافیلوکوکوس شناخته شده است( 8 ). با توجه به اهمیت استافیلوکوکوس اورئوس در عفونت های بیمارستانی ، آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی این باکتریها در منطقه در برنامه های کنترل ، پیشگیری ، درمان و پیش آگهی از پیامد عفونت حایز اهمیت می باشد(8 , 7).

1-4- اهداف پژوهش

هدف از این تحقیق  بررسی الگوهای ژنتیکی آنزیم کواگولاز استافیلوکوک اورئوس جدا شده از نمونه های بالینی و همچنین بررسی رابطه بین الگوی ژنتیکی آنزیم کواگولاز و نوع عفونت بالینی ناشی از این باکتری می باشد.

1-5- استافیلوکوک اورئوس

استافیلوکوک اورئوس یک کوکسی فاقد تحرک با قطر تقریبی 8/0 تا 1/0 میکرون می باشدکه در سه محور تقسیم شده و تجمعات نا منظم از سلول هایی شبیه به خوشه انگور را به وجود می آورد. در اسمیرهای برداشت شده از کشت که در محیط های جامد رشد کرده باشند باکتری ها در شکل تجمعات خوشه انگوری و نا منظم هستند اما در کشت های آبگوشت ترجیحاً زنجیره های کوتاه و فرم های دیپلوکوک، رایج تر می باشند. تعداد معدودی از سوش ها کپسول و یا لابه لعابی تولید می کنندکه قدرت بیماری زایی ارگانیسم را فزایش می دهد. استافیلوکوک اورئوس یک ارگانیسم گرم مثبت میباشد اما سلول های کهنه و ارگانیسم های فاگوسیتوز شده به صورت گرم منفی دیده می شوند(7 , 8 , 10).

1-6- جزئیات ساختمانی وتشکیلات سلول

ساختار زیربنایی استافیلوکوک مشابه با بقیه ارگانیسم های گرم مثبت می باشد. در مقاطع نازکی که از سلول های مرحله لگاریتمی برداشته شده باشد نوکلئوئید، مزوزوم و یک غشای سیتوپلاسمی سه ردیفی آشکار می شود که به وسیله ناحیه پری پلاسمی از دیواره سلول متمایز می گردد. در سوش های کپسول دار، یک لایه فیمبریه شکل و یا یک لایه کپسولی نیز ممکن است دیده شود. دیواره سلولی استافیلوکوک اورئوس مشتمل بر سه جزء اصلی: پپتیدوگلیکان، اسیدتیکوئیک و پروتئین A می باشد. محتوای اصلی این اجزاء دیواره سلولی در متمایز کردن استافیلوکوک از میکروکوک و استافیلوکوک اورئوس از استافیلوکوک اپیدرمیس مفید است. پپتیدوگلیکان در حدود 40 تا 60 درصد از وزن دیواره سلولی را به خود اختصاص می دهد.مقادیر بقیه اجزای دیواره سلولی متغییر است (7 , 8  ).