دانلود ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته مهندسی شیمی – بیوتکنولوژی

موضوع:ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک

 

چکیده 

دسفری اکسامینB،‌ تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته کننـده های کاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline  در محـیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O,ZnSO₄.7H₂O, MnCl₂, FeSO₄.7H₂O

و همچنین  اثرCaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار 8/2، و 2، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت  ^2-10 × 4/0، ZnSO₄.7H₂O و  6/0، MgSO₄.7H₂O و  2، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.

از طرفی استفاده همزمان CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O در محیط کشت Soy bean اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین را نشان داد.

همچنین بررسی ها در مورد آهن (بصورت FeSO₄.7H₂O)‌ نشان داد که افزایش غلظت آهن، سبب کاهش میزان دسفری اکسامین تولیدی گردید.

و اینگونه با استفاده از منابع نیتروژن و مواد معدنی مختلف بهینه سازی محیط کشت انجام گرفت و تولید دسفری اکسامین از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به میزان قابل ملاحظه ای افزایش یافت.

در این تحقیق، پروتئاز تولیدی از سویه استرپتومایسس پیلوسوس نیز بوسیله روش لوری (Lowry) اندازه گیری شد و اثر روی بصورت ZnSO₄.7H₂Oو آهن بصورت FeSO₄.7H₂O نیز بررسی گردید و مشاهده شد که افزایش غلظت روی، سبب افزایش پروتئاز تولیدی، از سویه مذکور گردید. ( بعضی از فرمولها به درستی در سایت قرار نگرفته اند ولی در فایل ورد مرتب می باشند)

 

فهرست مطالب

چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………. 1

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….. 3

فصل اول

1-1 – تالاسمی……………………………………………………………………………………………………………… 8

1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی………………………………………………………………………………… 8

1-2-1 – خون شناسی…………………………………………………………………………………………………….. 9

1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز……………………………………………………………………………….. 10

1-3- تالاسمی و انواع آن……………………………………………………………………………………………….. 10

1-3-1 آلفا تالاسمی………………………………………………………………………………………………………. 10

1-3-2- بتا تالاسمی……………………………………………………………………………………………………… 11

1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)……………………………………………………………………………… 11

1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی)…………………………………………………………………. 12

1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی…………………………………………………………………………………………. 13

1-4- تشخیص تالاسمی…………………………………………………………………………………………………. 13

1-5- درمان تالاسمی…………………………………………………………………………………………………….. 13

1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان………………………………………………………….. 14

1-6-1- مسمومیت حاد آهنی………………………………………………………………………………………….. 15

1-7- دسفرال……………………………………………………………………………………………………………… 16

1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال……………………………………………………………………………… 17

1-7-2-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی……………………………………………………………………… 18

1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال……………………………………………………………………………. 19

1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال………………………………………………………………… 19

1-7-5- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال………………………………………………………………………… 20

 

فصل دوم

2-1-  سیدرو فورها……………………………………………………………………………………………………… 22

2-1-1- هیدروکسامات ها……………………………………………………………………………………………… 24

2-1-2-فنولات ها یا کاتکولات ها……………………………………………………………………………………. 25

2-2- دسفری اکسامین ها……………………………………………………………………………………………….. 26

2- 2-1 – ساختمان دسفری اکسامین…………………………………………………………………………………. 28

2-2-2- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان………………………………………………………………………. 28

2-2-3 – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین…………………………………………………………… 29

2-2-4- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن………………………………… 29

2-2-5- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide……………………………………………………………………… 30

2-3-  دسفری اکسامین B………………………………………………………………………………………………. 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B…………………………………………………………………………………. 33

2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B……………………………………………………………………….. 33

2-4- تولید کننده­های دسفری اکسامین………………………………………………………………………………. 34

2-5- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها………………………………………………………………………… 35

2-6- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها……………….. 36

2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B……………………………………………………………… 37

فصل سوم

3-1- اکتینومیست ها…………………………………………………………………………………………………….. 40

3-2- استرپتومایسس ها…………………………………………………………………………………………………. 43

3-2-1- پاتولوژی………………………………………………………………………………………………………… 43

3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان……………………………………………………………………………………….. 43

3-2-3- مشخصات کلنی……………………………………………………………………………………………… 454

3-2-4- اسپورزایی……………………………………………………………………………………………………….. 47

3-2-5- ترکیبات پوشش سلولی………………………………………………………………………………………. 49

3-2-6- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی……………………………………… 49

3-2-6-1- تغذیه…………………………………………………………………………………………………………. 49

3-2-6-2- اکسیژن……………………………………………………………………………………………………….. 50

 

3-2-6-3 – رطوبت……………………………………………………………………………………………………… 50

3-2-6-4- دما…………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2-6-5- pH…………………………………………………………………………………………………………… 51

3-2-6-6- اکولوژی……………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس…………………………………………………………………… 53

3-2-7- انواع فرآورده های میکروبی…………………………………………………………………………………. 56

3-2-7-1- متابولیت های اولیه………………………………………………………………………………………… 56

3-2-7-2- متابولیت های ثانویه……………………………………………………………………………………….. 56

3-2-7-2-1- آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………. 58

3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک………………………………………………………….. 58

3-2-7-3- آنزیمها……………………………………………………………………………………………………….. 63

3-2-7-3-1- پروتئازها…………………………………………………………………………………………………. 63

3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی…………………………………………………………………………………. 67

3-2-7-3-1-1-1- رنین……………………………………………………………………………………………….. 67

3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی…………………………………………………………………………………… 67

3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی…………………………………………………………………………………. 67

3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی……………………………………………………………… 68

3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی…………………………………………………………………… 69

3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها………………………………………… 69

3-2-7-3-1-5- تجزیه…………………………………………………………………………………………………. 71

3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها……………………………………………………………………… 71

3-2-8- محیط کشت  تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………. 71

3-2-8-1- نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها……………………………………………………………………….. 71

3-2-8-1-1- کربن………………………………………………………………………………………………………. 74

3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها………………………………………………………………….. 77

3-2-8-1-2-نیتروژن……………………………………………………………………………………………………. 78

3-2-8-1-2-1-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها……………………………………………………………… 80

3-2-8-1-3- هیدروژن و اکسیژن…………………………………………………………………………………….. 80

 

3-2-8-1-4- مواد معدنی………………………………………………………………………………………………. 80

3-2-8-2-تنظیم کننده های متابولیکی……………………………………………………………………………….. 81

3-2-8-3- ضد کف ها…………………………………………………………………………………………………. 82

3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها………………………………………………………………………………. 83

فصل چهارم

4-1- دستگاه های مورد استفاده……………………………………………………………………………………….. 86

4-2- وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………. 86

4-3 – محیط های کشت مایع برای رشد باکتری…………………………………………………………………… 88

4-4- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری…………………………………………………………………… 89

4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور……………………………………………………………………………. 89

4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………. 90

4-7- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری……………………………………………………………… 91

4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des₄…………………………….. 91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean …………………. 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها……………………………………………………………… 92

4-11- معرف های دسفری اکسامین………………………………………………………………………………….. 92

4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B……………………………………………… 92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین…………………………………………………………………. 92

4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer………………………………………………………….. 93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl………………………………………………………………. 93

4-15- محلول کازئین %5/0 دربافر فسفات………………………………………………………………………….. 93

4-15-1- بافر فسفات (PBS)………………………………………………………………………………………… 93

4-16- محلول لوری (Lowry)………………………………………………………………………………………. 93

فصل پنجم

5 – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس………………………………………………………. 98

5 ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس…………………………………….. 98

5-٢-١- خصوصیات ماکروسکوپی……………………………………………………………………………………. 99

5- ٢-١-١- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد…………………………………………….. 99

 

5-٢-١-٢- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع……………………………………………………… 99

5-٢-٢ خصوصیات میکروسکوپی…………………………………………………………………………………….. 99

5-٢-٢-١- تهیه لام از محیط کشت جامد…………………………………………………………………………… 99

5-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط کشت مایع…………………………………………………………………………… 100

5ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………….. 100

5 ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………….. 100

5 ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره…………………………………………………………………………………………… 101

5 ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور…………………………………………………………………………………… 101

5ـ ۴ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس……………………………………………………………….. 101

5ـ ۵ـ بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean……………………………………………………….. 102

5ـ ۶ـ تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس…………………………………………………. 102

5ـ ۶ـ ١ـ تشخیص کیفی دسفری اکسامین………………………………………………………………………….. 102

5ـ ۶ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز……………………………………………………… 103

5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال…………………………………………………………………………….. 103

5-٧ـ استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم……………………………………………………………. 104

5 ـ ٧ـ ١ـ مزتیله کردن دسفری اکسامین…………………………………………………………………………… 105

5-8- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده…………………………………………………. 105

5ـ ٩ـ  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین…………………………………………………………. 107

5ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین…………………………………………….. 107

5 ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت………….. 107

5ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁)  ( برتولید دسفری اکسامین    108

5 ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین……………………………………… 108

5ـ ٩ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین……………………………………… 108

5 ـ ٩ـ ۵ـ  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean…………… 109

5 ـ ٩ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………… 109

5 ـ٩ـ۶ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین……………. 111

 

5 ـ ١٠ – بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف 112

5 ـ ١٠ـ ١ـ کشت باکتری و سنجش پروتئاز……………………………………………………………………….. 112

5 ـ ١٠ـ 2ـ تخلیص کازئین……………………………………………………………………………………………. 113

فصل ششم

6ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس…………………………… 115

6ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد……………………………. 115

6 ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع…………………………………… 115

6 ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس…………………………. 116

6 ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB…………………………………. 116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس 118

6 ـ ۵ـ تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی…………………………………………………………. 120

6-5-1- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین……………………………………………… 120

6ـ۵ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال………………………………………………………………………………. 120

6ـ۵ـ3ـ میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean……………………………………………………………………………………………………………………………… 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس……. 122

6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده……………………………. 122

6-7-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین…………………………………………………………. 124

6-7-1  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین………………………………………………. 124

6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت…………….. 124

6ـ7ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ )………………………………. 126

6 ـ 7ـ٣ـ بررسی گلوکز ، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین………………………………………….. 126

6ـ 7ـ ۴ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین………………………………. 127

6ـ 7ـ ۵ـ استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean…………….. 128

6 ـ 7ـ ۶ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین…………………………………… 128

6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین ………….. 130

 

6ـ8ـ بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته‌کننده و مواد معدنی مختلف. 139

فصل هفتم

– بحث و نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………….. 143

– پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………. 147

– فهرست منابع………………………………………………………………………………………………………….. 149

 

فرمت فایل: Word (قابل ویرایش)
تعداد صفحات: 173
حجم: 8.88 مگابایت

300,000 ریال – خرید نهایی کردن خرید مورد به سبد خرید اضافه شد